Supervisors

Úvod do projektu

Viry představují hrozbu v podobě nebezpečných onemocnění, ať už u člověka nebo i živočichů (ebola, chřipka). Nejnověji probíhající vysoce infekční pandemie koronavirem je toho zřejmým důkazem¹. Vhodné experimentální modelové systémy jsou intenzivně hledány za účelem vývoje vhodných léčebných a diagnostických přístupů.  Africký mor prasat je známý jako agresivní onemocnění prasat vyskytující se v ohniscích na různých kontinentech (pro člověka je zcela neškodný)². Virus je známý především kvůli vysoké letalitě čeledi prasatovití, která dosahuje téměř 100 %. Pandemie ASFV probíhá i v Evropě (v ČR bylo v roce 2017 potvrzeno 202 případů). Protiepidemická opatření mohou být různá (od dezinfekčních režimů, přes mírnou či úplnou karanténu oblastí až po důslednou eradikaci nemocných). Při všech je včasná diagnostika klíčová pro provedení daných opatření. Běžně užívané techniky identifikace viru vychází z průkazu přítomnosti virové nukleové kyseliny pomocí PCR případně povrchových antigenů imunologickými technikami. Specificita a senzitivita těchto metod je velmi dobrá, ale vždy vyžadují velmi dobré laboratorní zázemí a kvalifikovanou obsluhu. V případě globálních pandemií je potřebné využívat co nejrychlejších a finančně nenákladných přístupů přímo v terénu³. Virus, nukleové kyselina musí být imobilizována na vhodný povrch a usnadní tak vlastní proces identifikace⁴. Vhodným povrchem jsou magnetické částice (SPION). Lze na ně navázat různé molekuly (protilátky) a díky magnetickým vlastnostem je možná jejich snadná izolace z roztoku. Zelená syntéza spočívá ve využívání rostlinných či jiných extraktů jako redukčních činidel⁵.

Metodika

Superparamagntické zlaté nanočástice (SPION) a další nanočástice (AgNPs, AuNPs, CdTe, CdSe, ZnSe) jsou připravovány podle upravených postupů. Částice díky svým magnetickým vlastnostem mohou být snadno promyty případně modifikovány. Na povrchu SPION je vrstva zlatých nanočástic, které mají velmi dobrou afinitu k nukleovým kyselinám. Po vazbě nukleové kyseliny viru na SPION je možné tuto prokázat za využití vhodné oligonukleotidové sondy⁶. Je-li sonda označena můžeme takovou značku rozpoznat⁷. Jako vhodné značky lze využít kvantové tečky (CdTe, CdSe, ZnSe, ZnS). Vazbu sondy k virové nukleové kyselině lze detekovat různými metodami⁸. Při studiu interakce bude využíváno především elektrochemické detekce, jak nukleové kyseliny, tak kvantové tečky^9,10. Analýza probíhá na analyzátoru AUTOLAB ve spojení s VA-Stand 663 v tří elektrodovém zapojení: a) pracovní elektroda – visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) b) referenční elektroda – Ag/AgCl/3M KCl a c) pomocná elektroda – uhlíková. Všechna elektrochemická měření jsou provedena v pufrovaném prostředí.

Cíle práce

Cílem práce je připravit komplex superparamagnetické nanočástice oxidu železitého s navázanými zlatými nanočásticemi na povrchu. SPION budou připraveny klasickou i zelenou syntézou. K zelené syntéze bude použit extrakt ze Salvia officinalis, která se hojně využívá díky svým antimikrobiálním vlastnostem¹¹. Proběhne detailní charakterizace částí komplexu pomocí chemických (kolorimetrické metody, elektrochemie) a fyzikálních (luminiscence, gelová elektroforéza) metod. Pro práci byly navrženy následující cíle:

1. Zpracovat literární přehled detekce virů za využití nanotechnologie
2. Připravit vybrané nanočástice (CdTe, CdSe, ZnSe, ZnS, SPION)
3. Značit nukleové kyseliny vybranou kvantovou tečkou a optimalizovat detekci její přítomnosti
4. Vypracovat postup pro vazbu nukleové kyseliny na SPION a hybridizaci ODN sondy
5. Za využití techniky adsorptivního přenosu studovat průběh hybridizace
6. Navrhnout postup pro identifikace viru z reálného vzorku

Výstupy

1)         Vypracování práce SOČ.

2)         Konferenční příspěvek na Tomáškovy dny mladých mikrobiologů, červen 2020

3)         Konferenční příspěvek na Setkání biochemiků a molekulárních biologů Brno 2020.

 

 

Vybraná literatura

1          York, A. Novel coronavirus takes flight from bats? Nat. Rev. Microbiol., 1, doi:10.1038/s41579-020-0336-9.

2          Wang, N. et al. Architecture of African swine fever virus and implications for viral assembly. Science 366, 640-+, doi:10.1126/science.aaz1439 (2019).

3          Xu, S. C. et al. Real-time reliable determination of binding kinetics of DNA hybridization using a multi-channel graphene biosensor. Nat. Commun. 8, 10, doi:10.1038/ncomms14902 (2017).

4          Tavallaie, R. et al. Nucleic acid hybridization on an electrically reconfigurable network of gold-coated magnetic nanoparticles enables microRNA detection in blood. Nat. Nanotechnol. 13, 1066-+, doi:10.1038/s41565-018-0232-x (2018).

5          Ishak, N. A. I., Kamarudin, S. K. & Timmiati, S. N. Green synthesis of metal and metal oxide nanoparticles via plant extracts: an overview. Mater. Res. Express 6, 32, doi:10.1088/2053-1591/ab4458 (2019).

6          Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D. & Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379, doi:10.1038/nprot.2008.115 (2008).

7          Strohsahl, C. M., Miller, B. L. & Krauss, T. D. Preparation and use of metal surface-immobilized DNA hairpins for the detection of oligonucleotides. Nat. Protoc. 2, 2105-2110, doi:10.1038/nprot.2007.301 (2007).

8          Lin, M. H. et al. Electrochemical detection of nucleic acids, proteins, small molecules and cells using a DNA-nanostructure-based universal biosensing platform. Nat. Protoc. 11, 1244-1263, doi:10.1038/nprot.2016.071 (2016).

9          Zhang, J., Song, S. P., Wang, L. H., Pan, D. & Fan, C. H. A gold nanoparticle-based chronocoulometric DNA sensor for amplified detection of DNA. Nat. Protoc. 2, 2888-2895, doi:10.1038/nprot.2007.419 (2007).

10        Ferguson, J. A., Boles, T. C., Adams, C. P. & Walt, D. R. A fiber-optic DNA biosensor microarray for the analysis of gene expression. Nat. Biotechnol. 14, 1681-1684, doi:10.1038/nbt1296-1681 (1996).

11        Bozin, B., Mlmica-Dukic, N., Samojlik, I. & Jovin, E. Antimicrobial and antioxidant properties of rosemary and sage (Rosmarinus officinalis L. and Salvia officinalis L., lamiaceae) essential oils. J. Agric. Food Chem. 55, 7879-7885, doi:10.1021/jf0715323 (2007).